北京生科院开采病原菌泛素化宿主蛋白并拉动感染的分子机制,东京生科院发掘泛素功率信号调解细胞自噬

7月28日,学术期刊PLOS
Pathogens
在线发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所胡荣贵研究组的论文图片 1图片 2Bacterial
effector NleL promotes
图片 3enterohemorrhagic
E. coli-induced attaching and effacing lesions by ubiquitylating and
inactivating JNK
。该研究阐释了肠出血性大肠杆菌EHEC
O157:H7的毒力蛋白NleL通过泛素化宿主JNK蛋白从而促进细菌感染的新分子机制。

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肠出血性大肠杆菌是一类可引起严重食源性疾病的致病菌,其中最重要的是血清型为O157:H7的菌株。EHEC
O157:H7是导致人和牲畜发生腹泻和出血性肠炎的主要原因之一,其引起的爆发感染逐年增加。EHEC
O157:H7感染时会在宿主细胞上引起特征性的A/E损伤,形成独特的肌动蛋白聚集结构actin
pedestals;A/E损伤的出现是EHEC成功感染宿主的标志之一。一种来源于EHEC
O157:H7的细菌效应蛋白NleL曾被证实在体外具有类真核生物泛素连接酶的活性,但是其在EHEC感染过程中的生物学特性及作用机理尚未清楚。

自噬受体蛋白 p62 感应正向泛素胁迫,通过不依赖于 E3
的自泛素化,由自我抑制状态被激活,调控细胞选择性自噬功能的分子机制示意图。

EHEC在感染过程中可以将NleL蛋白传递到宿主细胞内。该研究发现,细菌蛋白NleL能够结合宿主JNK蛋白并对其特定位点进行单泛素化修饰和多泛素修饰。更为重要的是,NleL还可以有效地抑制JNK的磷酸化激活。NleL对JNK特定位点的单泛素化修饰干扰了JNK与上游磷酸激酶MKK7的结合,从而抑制了JNK磷酸化激活,进而抑制了下游c-Jun的磷酸化及转录因子AP-1的活性。AP-1还被发现可以参与调节actin
pedestals的形成;而且NleL最终被证实可以通过抑制宿主JNK/AP-1通路来促进EHEC粘附宿主并形成A/E损伤。通过选用在结构和功能上类似于结肠上皮的人源Caco-2单层细胞模型进行体外细菌感染实验,发现EHEC可以在Caco-2单层上形成明显的A/E损伤,可用来替代体内感染实验,弥补EHEC不能以普通小鼠作为实验动物的缺陷。该项研究首次发现了NleL的作用底物并明确了NleL在EHEC感染过程中的生物学意义。这也是JNK蛋白首次被报道可以被进行泛素化修饰且泛素化修饰负调控磷酸化激活。

5 月 5
日,学术期刊《细胞研究》正式发表了中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所胡荣贵研究组的最新研究成果
Ubiquitylation of p62/Sequestosome1 Activates Its Autophagy Receptor
Function and Controls Selective Autophagy Upon Ubiquitin
Stress。该项研究阐述了泛素信号在自噬受体水平调控细胞自噬的新机制,揭示了细胞内起核心作用的自噬受体蛋白
p62 作为感应泛素胁迫感应器调控细胞选择性自噬活性,应对药物、热激
等生理病理相关胁迫的基本的分子机制。

该项研究是在胡荣贵的指导下,由盛相鹏、尤青等完成。该项研究工作得到北京生命科学研究所教授邵峰,中科院微生物研究所高福、严景华,上海生科院生化与细胞所阮康成、王红艳、惠利健、曾嵘、林安宁、王琛以及东北农业大学教授师东方的大力支持。质谱数据由曾嵘课题组博士李青润协助完成。经费支持来自中科院分子细胞科学卓越创新中心、中科院先导计划、国家自然科学基金委医学部的国家杰出青年基金和生命学部、国家科技部、信号传导网络协同创新中心。该工作的数据收集还得到了生化与细胞所细胞生物学平台、分子生物学平台和动物实验技术平台的支持。

自上世纪六十年代,泛素
分子被首次发现以来,人们发现泛素作为一类重要信号分子,通过泛素激活酶
、泛素连接酶 顺序催化的泛素化修饰 (Ubiquitylation 或 ubiquitination)
以及去泛素化酶参与的去泛素化修饰(deUbiquitylation 或
deubiquitination),以可逆、可诱导的方式调节细胞内几乎所有重要的生命活动。泛素化信号的异常与肿瘤、神经退行性疾病、神经认知遗传缺陷如孤独症等密切相关,但其机理目前的认识却尚处于不断深入的阶段。在真核生物中都可有多个基因编码泛素蛋白,是细胞内含量最高的基因编码的产物之一,达到近
500μM。在细胞内主要以自由和偶联的两种方式存在,多项研究表明,胞内泛素分子的丰度及稳态变化在细胞内外不同生理病理刺激的作用下,呈现复杂多样的变化,被统称为泛素胁迫。例如,当细胞处于热激、药物处理、衰老、病原体感染等状态下,细胞内的泛素基因的转录水平显着变化,在亚细胞水平的稳态分布也会发生异常改变。研究表明,胞内泛素水平异常也会影响从酵母到人类细胞或机体生命活动的诸多方面,例如泛素基因突变或水平不足的小鼠,小鼠则表现为神经退行性疾病症状以及肝脏发育缺陷;泛素过表达的细胞则表现出类干细胞的某些特征、影响肿瘤细胞的药物反应,但是分子机制一直都不清楚。

胡荣贵研究组博士彭虹、杨娇作为共同第一作者,首先发现泛素胁迫在接受化疗的肿瘤病人的细胞内真实存在。他们接下来进一步定义了泛素胁迫的概念,将多种影响细胞内泛素稳态的条件根据泛素总体水平被上调还是下调分别定义为正向泛素胁迫
和泛素负向胁迫。研究发现,正向泛素胁迫如蛋白酶体抑制剂类药物的肿瘤化疗或细胞处于热激状况时,细胞内泛素水平明显上升并伴随有依赖
p62 的细胞选择性自噬的激活;而泛素负向胁迫条件下则细胞自噬被严重抑制。

进一步研究发现,通常情况下,细胞内最重要的自噬受体蛋白之一 p62,通常由于
N 端的 PB1 结构域、C 端的 UBA
结构域间的分别结合形成稳定的二聚或多聚体而处于不能与底物结合的自我抑制
状态,而使细胞内自噬活性保持较低的水平。他们首次发现 P62 可以与两类 E2
泛素偶联酶发生特异性的直接相互作用,并发生自泛素化修饰。当细胞内的泛素水平显着升高时,p62
会更加显着地发生 E2- 依赖的泛素化,经泛素化修饰的 p62
蛋白构象会发生改变,C- 端的 UBA
二聚体被打开,而处于可以与泛素化底物结合的活化“active”状态,从而更有效地募集结合被
K63- 连接的多泛素链修饰的自噬底物。这些研究成果首次揭示 p62 不依赖与 E3
的自泛素化修饰,发挥感受泛素胁迫的效应器的功能,并调控细胞自噬,介导细胞对肿瘤的药物化疗药物敏感性、热激效应以及外源微生物侵染等的新的分子机制。

该研究组之前报道了具有肿瘤抑制活性的泛素连接酶 HACE1
可以通过泛素化自噬受体
OPTN,调控自噬受体复合物形成,增加细胞自噬途径降解的通量并抑制多种肿瘤发生发展的机制(Liu
et al Cancer Cell
2014)。在揭示了泛素信号调节自噬复合物形成的基础上,该研究在自噬受体层面揭示了泛素信号调节自噬受体功能开关,调控细胞反应的新机制,不仅帮助人们从机制上理解此前困惑已久的一系列生物学现象,为研究细胞应对各种刺激的分子机制提供了新的研究视角,也可能有助于优化设计通过干预细胞自噬提高肿瘤诊疗效果的方案。

绝大多数实验室在研究胞内特定蛋白质泛素化及其功能性影响时都会涉及到过表达带标签的泛素,而该研究发现,在几乎所有研究的细胞类型内,如果过表达泛素蛋白,无论有无标签,到一定的水平都可以导致人为的泛素正向胁迫而激活细胞自噬。很显然,无论泛素领域内外的人们,都普遍忽略了自噬被人为激活的可能,从而在解释很多实验现象时,欠缺完整考虑甚至造成完全的误导。该项研究明确提醒人们,在研究胞内泛素信号相关的生物学问题时,必须避免因盲目地过表达泛素而在自己的实验体系内人为激活细胞自噬。

研究工作得到哈佛医学院教授 Daniel Finley、歌德大学法拉克福生化所教授
Ivan
Dikic、新潟大学教授小松雅明,特别是北京军事医学科学院张学敏团队,生化与细胞所研究员何勇宁、黄旲、高大明、王红艳、惠利健的大力支持。电镜和动态光散射数据由生化与细胞所何勇宁课题组博士李光一帮助完成。p62
蛋白二聚体结构分析由黄旲指导完成。质谱数据由曾嵘课题组成员李青润以及黄超兰等协助完成。临床样本收集方面得到长征医院血液科教授侯健团队和华山医院中心实验室博士张弢的大力支持。实验数据收集过程中得到生化与细胞所公共技术服务中心分子和细胞平台的技术支持。该研究得到中科院分子细胞科学卓越创新中心、中科院先导计划、国家自然科学基金委医学部的国家杰出青年基金和生命学部项目基金、国家科技部项目、信号传导网络协同创新中心提供的经费等支持。